LA TRANSGENIA COMO ALTERNATIVA EN LA MEJORA GENETICA DE PECES Prof. Dr. M*. Carmen Alvarez. Dpto. Biologia Celular y Genetica. Facultad de Ciencias. Universidad de Malaga. La aplicacion de los metodos convencionales de seleccion genetica a especies piscicolas de interes economico se ha restringido a casos muy puntuales, y ha alcanzado en conjunto un exito muy pobre, sobre todo por la lentitud del proceso y por los altos costos que conlleva (5). Esta situacion un tanto decepcionante ha propiciado la busqueda de alternativas que permitan aumentar la productividad de estas especies en el marco de la moderna Acuicultura. Precisamente estos organismos presentan caracteristicas privilegiadas para aplicar en ellos tecnicas de manipulacion genetica: el gran numero de huevos producidos por cada hembra, su taman~o y su accesibilidad para ser fecundados bajo condiciones controladas. De entre los tipos de manipulacion genetica empleados, destacan los de manipulacion cromosomica, por su simplicidad y costo reducido siendo la ginogenesis, la androgenesis y la poliploidia los mas importantes (6). Los dos primeros se estan utilizando en plan experimental para producir lineas homocigoticas y poblaciones monosexo y su interes comercial es todavia una incognita. De la poliploidia se podria esperar en principio lograr individuos de crecimiento mas rapido, pero los datos disponibles hasta ahora son insuficientes para valorar esta cualidad. En cambio el mayor interes actual de esta tecnica se basa en el aprovechamiento de la esterilidad de los triploides . Las caracteristicas favorables de los cigotos de peces para su manipulacion, junto con la disponibilidad de secuencias genicas clonadas en gran numero de especies, crean una atmosfera propicia, para utilizar la transgenia en la mejora genetica de estas especies. El fundamento de esta tecnologia consiste en introducir, en un huevo fecundado, multiples copias extras de genes clonados, propios o extran~os, con el fin de obtener un aumento del producto de ese gen, lo cual a su vez puede desencadenar cambios dramaticos en el organismo receptor. El espectacular crecimiento de los ratones transgenicos inyectados con genes de hormona de crecimiento humana y de rata (8) fue sin duda el detonante para incorporar la transgenia a la mejora genetica de especies domesticas. En el caso concreto de los peces ha despertado tanto interes, que esta aglutinando un gran esfuerzo investigador. Asi a partir de la primera referencia de la transferencia del gen de la hormona de crecimiento humana a la carpa dorada (9), se han sucedido otros muchos trabajos que recogen la integracion, expresion, transmision e incluso un aumento en la tasa de crecimiento de peces transgenicos en al menos 14 especies que incluyen: carpas, percas, salmonidos (Fig. 1), tilapias, pez cebra, pez gato y lucio, entre otras. ETAPAS 1- Obtencion de la secuencia genica y de las secuencias controladoras flanqueantes que permitan expresar con precision su informacion (promotor-potenciador) formando asi un DNA recombinante funcional o "vector de expresion". Para ello se usa normalmente DNA genomico en lugar de cDNA por llevar incorporados los intrones. 2- Clonado del gen. Aislamiento y purificacion: La unidad de transferencia tiene que ser clonada en un vector y mantenida en una estirpe bacteriana adecuada. 3- Recoleccion de gametos y fecundacion: Esta se efectua mezclando los huevos y el semen en un recipiente con agua. 4- Microinyeccion: Las secuencias que se van a inyectar pueden encontrarse bien en forma lineal o circular. La mayoria de los laboratorios adoptan la forma lineal ya que la recombinacion es supuestamente mas facil. Los defensores de la forma circular aducen que en esta configuracion las moleculas serian mas resistentes a la degradacion enzimatica. La solucion, que se colorea para poder seguirle la pista, se carga en agujas de cristal de borosilicato que se acoplan al equipo de microinyeccion (Fig. 2) con el que introducen las secuencias en el polo animal del huevo antes de la primera division. Como el nucleo de estos huevos es tan pequen~o la inyeccion es ciega y en la mayoria de los casos las secuencias caen en el area perinuclear. La inmovilizacion de los huevos sobre una base de agar parece bastante eficaz y facilita la penetracion de la aguja (Fig. 3). Aunque la microinyeccion ha sido hasta ahora el unico metodo exitoso en la transferencia en peces, resulta laborioso y un tanto impreciso. Por ello se esta trabajando en el desarrollo de otras alternativas que aumenten la eficacia y precision de la transgenia, son los llamados metodos de transferencia en masa tales como "adsorcion del DNA al esperma", "electroporacion", "transferencia balistica" y "lipofeccion". De todos ellos parece que la lipofeccion, o encapsulacion del DNA transgenico en una membrana fosfolipidica que se fusiona con la membrana celular, es la que ofrece mejores perspectivas. 5- Incubacion: Las condiciones de mantenimiento de los huevos despues de la inyeccion no difieren de las utilizadas habitualmente. Siempre se deben mantener lotes control con fines comparativos. 6- Pruebas de transgenismo: El procedimiento normal para identificar transgenicos consiste en purificar DNA a partir de un lote de larvas, individuos aislados, o muestras de tejidos de adultos y someterlos a un analisis "dot-blot". Sin embargo esta prueba solo indica la persistencia de una o mas copias de la secuencia inyectada, no su integracion en el genoma, por lo que es esencial realizar una prueba "Southern-blot" en los individuos positivos. Esta ha revelado que el numero de copias transgenicas por pez oscila desde menos de 1 (copias incompletas) hasta algunos cientos que forman frecuentemente concatenados y que en cualquier caso pueden mantenerse integradas o independientes. Un trabajo reciente (3) revela que mientras en los embriones las secuencias aparecen tanto integradas como no, en adultos solo se detectan en forma integrada, lo cual apoyaria la idea de que las secuencias que no se integran se perderian a lo largo del desarrollo En cualquier caso es altamente probable que la integracion del DNA exogeno ocasione cambios en el genoma del pez transgenico. Sin embargo no parece que estos produzcan efectos drasticos en la viabilidad de los huevos y embriones inyectados, como se desprende de los valores de supervivencia que no son significativamente diferentes entre los peces transgenicos y los controles. 7- Expresion del transgen. Una etapa esencial de esta tecnologia, por razones obvias, es la expresion de los productos codificados en el gen elegido, pudiendo llevarse a cabo este analisis tanto a traves de la deteccion de sus correspondientes RNA como de sus productos proteicos (Fig4). Esta ultima alternativa presenta una informacion mas util y completa del proceso siendo por ello la mas utilizada. Dado que los niveles de expresion obtenidos hasta el momento no son muy elevados se estan intentando mejorar con el uso de promotores mas eficientes. Muchos grupos han utilizado el promotor de la metalotioneina del raton, que es un promotor universal, siguiendo el modelo de estudios ya clasicos de transgenia en el raton. Con otros promotores como los de los virus SV40 y RSV, se han obtenido niveles de expresion mas altos que con el de la metalotioneina (revisado en 4), pero sin lugar a duda los mejores resultados se estan consiguiendo con los promotores de origen piscicola y es precisamente en esta linea en la que se esta potenciando su obtencion. 8- Obtencion de lineas transgenicas. Ello presupone la integracion de los transgenes en la linea germinal para que se transmita a la descendencia, lo cual ocurre con una frecuencia muy baja. No obstante hay varias evidencias de transmision del transgen a la siguiente generacion (7) y (Guise, K. U. de Minnesota E.E.U.U, comunicacion personal). Posteriormente para que se instauren las lineas transgenicas, son necesarias varias generaciones de cruzamientos para que los nuevos genes alcancen frecuencias suficientemente altas que permitan valorar su rendimiento antes de ser elegidas como reproductoras en programas convencionales de acuicultura. GENES DE INTERES ECONOMICO EN PECES Aunque en esta fase inicial de la transgenia en peces la mayoria de los esfuerzos se han encaminado a conocer aspectos basicos de la metodologia, en muchos casos se han empleado directamente genes que pueden ser interesantes en acuicultura, como los relacionados con el crecimiento, eficiencia alimentaria, resistencia a enfermedades o adaptacion a condiciones ambientales especificas. Merece destacar la intensa busqueda que en los ultimos an~os se esta llevando a cabo de genes del crecimiento en general y genes de la hormona de crecimiento en particular. De estos ultimos se han logrado clonar en mas de una decena de especies, algunas de origen marino. Se esta trabajando ademas en la identificacion de otros posibles genes reguladores del crecimiento que pudieran tener cierto paralelismo con los que existen en vertebrados superiores utilizando para su clonacion sondas de secuencias de mamiferos. Un estudio reciente (3) revela un aumento de crecimiento del 20% en la generacion inyectada del lucio americano, cuyos huevos fecundados habian sido inyectados con genes de hormona de crecimiento bovina y de salmon. Estos resultados son sin duda esperanzadores. Otro tipo de genes relevantes para la mejora genetica es el de las proteinas anticongelantes con capacidad de descender el punto de congelacion del suero y que poseen de forma natural las especies que habitan en mares polares. Un gen de estas caracteristicas se ha aislado en la platija americana y se ha inyectado con exito en el salmon atlantico (1) aunque su expresion ha sido insuficiente como para proteger de la congelacion a los transgenicos. Niveles suficientes de esta proteina permitirian sin embargo cultivar el salmon en granjas donde el agua llega a congelarse en invierno. Los genes de las metalotioneinas han sido tambien de eleccion en la transgenia por el poder detoxificante de sus proteinas al formar complejos con metales pesados existentes en las celulas. Su utilidad para la supervivencia de los peces en aguas contaminadas con metales pesados es obvia. Es muy probable que en un futuro no muy lejano el objetivo principal de la transgenia se encamine a aumentar la resistencia a enfermedades en los organismos acuaticos. Los primeros pasos en este sentido se concretan en peces en el aislamiento de los genes de las proteinas de la capsida del virus de la necrosis hematopoyetica y del virus de la necrosis pancreatica (2) que se piensan insertar en vectores de expresion y ser transferidos a huevos de peces a fin de valorar su capacidad para conferir resistencia a estos virus PERSPECTIVAS a) Inclusion de especies nuevas en el catalogo de la transgenia de peces. b) Optimizacion de las distintas etapas para lograr una metodologia mas eficaz en todas sus facetas. En este sentido se deben desarrollar los metodos de transferencia en masa, para simplificar el proceso, aumentar la integracion y disminuir el mosaicismo. c) Integracion dirigida, para que ocurra en puntos especificos del genoma. Experimentos de este tipo ya se han iniciado en peces (4) utilizando como secuencias flanqueantes aquellas que presentan un alto grado de repeticion en el genoma del pez. d) Expresion del nuevo gen en sus tres dimensiones: "cuanto, cuando y donde" y que depende de lleno de los factores reguladores, por lo que el desafio en esta fase es utilizar en cada caso elementos reguladores que permitan patrones de expresion adecuados a los fines del experimento. Asi la expresion de los genes del crecimiento podria optimizarse utilizando promotores que sean muy activos en el tejido muscular durante las fases juveniles pero que se desactiven al llegar a la madurez sexual. En cuanto a la expresion de los peptidos anticongelantes esta deberia restringirse solo a la epoca fria del an~o y podria regularse por los niveles de serotonina en el suero del pez. CONSIDERACIONES FINALES Aunque se han hecho progresos muy rapidos en la obtencion de peces transgenicos, existen aun limitaciones que retrasan su utilizacion en acuicultura para ser explotados en plan industrial. a) Son necesarias muchas generaciones para obtener, dentro de una linea transgenica, un numero de individuos suficientes como para evaluar su rendimiento, sin incurrir en excesiva consanguinidad. Tengamos en cuenta que el tiempo de generacion en especies cultivables es de 2 o 3 an~os. b) Disponer de tecnicas efectivas de esterilizacion funcional tanto para la proteccion del propio stock, como para evitar posibles impactos ecologicos por escapes de transgenicos, ocasionados bien directamente a traves de sus fenotipos alterados o al reproducirse con poblaciones naturales conespecificas. c) Necesidad de instrumentar una normativa que regule los ensayos con transgenicos dentro de ambientes controlados, asi como la utilizacion practica a que deben destinarse. Ambas cuestiones son objeto de fuertes controversias en paises donde esta tecnologia esta en pleno desarrollo. Literatura citada 1. Davies, P.L., Fletcher, G.L. y Hew, C.L. 1989. N. Maclean, Ed. Oxford Surveys on Eukaryotic Genes, vol 6, Oxford University Press, pp. 85-109. 2. Gilmore, R.D. y Leong, J.C. 1988, Virology 167, 644-648. 3. Gross, M.L., Schneider, J.F., Moav, N., Alvarez, M.C., Myster, S.H., Liu, Z., Hallerman, E.M., Hackett, P.B., Guise, K.S., Faras, A.J. y Kapuscinski, A.R. Aquaculture (en prensa). 4. Hallerman, E.M., Kapuscinski, A.R., Hackett, P.B., Faras, A.J. y Guise, K.S. 1989. 34th Atlantic Fisheries Technology Conference, New Founland, 5. Lopez- Fanjul, C., Toro, M.A. 1990. En Mejora genetica de peces y moluscos, Mundi Prensa, pp. 107. 6. Lozano, R., Ruiz-Rejon, C. y Ruiz-Rejon, M. 1987. En Manipulacion cromosomica en organismos acuaticos. C.A.I.C.Y.T. Genetica en Acuicultura. Mundi Prensa, pp. 215-246. 7. Mclean, N., Penman, D. 1990. Aquaculture 85, 1-20 8. Palmiter, R.D., Brinster, R.L., Hammer, R.E., Trumbauer, M.E., Rosenfeld, M.G., Brinberg, N.C. y Evans, R.M. 1982. Nature 300, 611- 615. 9. Zhu, Z., Liu, G., He, L. y Chen, S. 1985. Z. Angew Ichthyol 1, 31-34