Ingenieria genetica en plantas.




Jose Antonio Fernandez Perez
Instituto de Desarrollo Regional.  Universidad de Castilla-La Mancha. 
Albacete








Objetivos


La disponibilidad de sistemas eficientes de transformacion en especies 
cultivadas ha permitido la aplicacion de estas tecnicas a la mejora. En 
el momento presente mas de 50 especies de plantas cultivadas pueden ser 
transformadas por ingenieria genetica (cuadro 1). Esta cifra incluye 
muchas dicotiledoneas importantes y un numero creciente de 
monocotiledoneas como el arroz, el maiz y el trigo.  Inicialmente la 
investigacion se ha dirigido a aquellos caracteres directamente 
relacionados con los problemas agricolas como son el control de 
insectos, malas hierbas y enfermedades de los cultivos. Los progresos 
han sido rapidos y ciertos genes que controlan estos caracteres ya han 
sido introducidos con exito en bastantes especies cultivadas. Lineas 
manipuladas geneticamente de soja, algodon, arroz, maiz, colza, 
remolacha azucarera, tomate y alfalfa han entrado en el mercado a partir 
del an~o 1993  (cuadro 2).   La investigacion en la manipulacion 
genetica de otros caracteres como  tolerancia al estres,  eficiencia 
fotosintetica, asimilacion de nitrogeno y composicion de las proteinas 
de semilla esta menos avanzada, debido a las dificultades intrinsecas de 
los sistemas fisiologicos y geneticos implicados. Otras nuevas lineas de 
investigacion estan dando resultados espectaculares, como la regulacion 
de la maduracion del fruto, la produccion de formas androesteriles, y el 
uso de las plantas transgenicas como fabricas de moleculas valiosas, 
como por ejemplo, anticuerpos funcionales humanos.




a) Resistencia a insectos.


Los mayores progresos en la obtencion de plantas transgenicas 
resistentes a insectos han sido conseguidos a partir de la proteina 
insecticida de Bacillus thuringensis.  La mayor parte de las cepas de B. 
thuringensis   son toxicas para larvas de lepidopteros, aunque algunas 
lo son para larvas de coleopteros o dipteros. Su toxicidad radica en una 
proteina grande (toxina Bt), la cual no es toxica para los insectos 
beneficiosos, otros animales u hombres. El modo de accion de esta 
proteina parece implicar al nivel de disrupcion del transporte ionico de 
membranas.   Mediante mutagenesis dirigida se ha conseguido mejorar unas 
100 veces la eficacia de la proteina Bt  en tabaco, partiendo de la 
hipotesis de que la secuencia adaptada de un procarionte Gram-positivo 
podria no ser la mas adecuada para su expresion  en el genoma 
eucariotico de la planta. Otras moleculas con actividad insecticida 
provienen del reino vegetal. Son los inhibidores de enzimas (inhibidores 
de proteasas, e inhibidores de alfa-amilasas),  lectinas, y proteinas 
similares a las lectinas (arcelina).  El primer gen de origen vegetal 
transferido con exito a otra especie vegetal fue el inhibidor de 
tripsina del guisante forrajero en tabaco. Esta proteina es eficaz 
contra varias plagas de campo y de almacen que incluyen lepidopteros, 
coleopteros y ortopteros, y se ha transferido con exito a tomate y 
patata.  Los inhibidores proteicos de alfa-amilasas, abundantes en las 
semillas de muchas plantas,  parecen proteger del ataque de algunos 
insectos,  pero estan aun en una fase temprana de su estudio. Lo mismo 
ocurre con las lectinas y proteinas similares.  Ultimamente se viene 
ensayando el cruzamiento entre  plantas transgenicas portadoras de 
distintos genes insecticidas (p. ejem. inhibidor de tripsina x lectina) 
con el fin de comprobar el efecto combinado de ambos agentes en las 
plantas de la descendencia. Aunque los efectos de los agentes 
insecticidas no son sinergicos, los resultados parecen ser  alentadores.






b) Control de malas hierbas.


La manipulacion genetica de la tolerancia a herbicidas representa una 
alternativa para conferir selectividad y aumentar la seguridad de los 
cultivos frente a tales compuestos. La investigacion se ha centrado 
prioritariamente en aquellos herbicidas con alta actividad, baja 
toxicidad, escasa movilidad en los suelos, biodegradacion rapida y 
amplio espectro de accion.    En la manipulacion genetica de la 
tolerancia a herbicidas se han adoptado tres estrategias: (i) alterar el 
nivel de expresion del enzima diana para el herbicida, (ii) alterar el 
lugar de accion de herbicida  (iii) incorporar un gen que detoxifique al 
herbicida.  Las fuentes de genes de resistencia a herbicidas son 
principalmente bacterias (spp. de los generos Rhizobium, Escherichia, 
Chlamydomonas, Aerobacter,  Salmonella, Streptomyces ), cloroplastos (de 
la sp. Amaranthus hybridus ), levaduras, y mutantes celulares de plantas 
(tabaco, petunia, zanahoria, Arabidopsis thaliana, Corydalis 
sempervirens).  




c) Resistencia a enfermedades.


Se ha conseguido resistencia significativa al virus del mosaico del 
tabaco (VMT) en plantas transgenicas mediante la expresion del gen de la 
proteina de la cubierta del virus, en un proceso que se ha denominado 
Rproteccion mediada por la proteina de la cubiertaS. Este abordaje 
produce resultados similares en tomate, tabaco y patata contra un amplio  
espectro de patogenos como el virus del mosaico de la alfalfa, el virus 
del mosaico del pepino, y los virus X e Y de la patata. El mecanismo de 
proteccion parece implicar la interferencia del producto del gen con las 
particulas virales desnudas antes de la traduccion y replicacion del 
virus. Plantas transgenicas que portan el gen de la proteina de la 
cubierta del VMT han sido evaluadas en invernaderos y campos de pruebas, 
habiendo mostrado alta resistencia a la infeccion virica.   Otro metodo 
de proteccion es la introduccion de copias de DNA-c del llamado ARN 
satelite en plantas cultivadas. Este ARN satelite esta  presente en los 
cultivos de virus y determina un decrecimiento importante en la 
infectividad de estos.  En las plantas transgenicas el ARN satelite se 
replica cuando el virus infecta,  aminorando los efectos del virus.  
Abordajes similares se basan en la interferencia con la replicacion del 
virus  por parte de moleculas defectuosas de ARN provenientes de formas 
delecionadas del propio virus, o empleando la tecnologia del ARN 
antisentido  con genes de la capsida del virus.   A partir del  ARNm se 
obtiene el DNA-c correspondiente, cuya transcripcion produce copias de 
mensajero complementarias al ARNm de partida.  Estas moleculas 
complementarias  se aparean base a base formando una doble helice de 
ARN, lo que impide la traduccion del ARNm. Plantas de tabaco 
transformadas con la secuencia de un gen no-estructural del  VMT  
(posiblemente un componente del complejo de la replicasa) muestran una 
resistencia total al virus, incluso al concentraciones de viriones muy 
altas. No se ha detectado el producto genico y se desconoce si la 
resistencia es debida a la proteina o a su acido nucleico.




Otro  abordaje encaminado a conferir resistencias a virus se basa en el 
empleo de moleculas hibridas de ARN, consistentes en secuencias 
cataliticas del ARN satelite con actividad endonucleasica ligados a 
secuencias de ARN antisentido,  llamadas ribozimas. Recientemente se 
descubierto que plantas transgenicas de tabaco que expresan ribozimas 
contra el virus del mosaico del tabaco muestran cierta resistencia a la 
infeccion.  El uso de ribozimas en la proteccion vegetal  se encuentra 
aun en sus comienzos y requiere mucho mas esfuerzo investigador para 
descubrir sus posibilidades.




Tambien se ha avanzado en la obtencion de plantas transgenicas 
resistentes a bacterias y hongos. Por ejemplo, en tabaco se obtuvieron 
plantas que expresan un gen de quitinasa de la alubia y que son 
resistentes al hongo Rhizoctonia solani,  y plantas transgenicas que 
incorporan un gen de tionina de cebada que les confiere resistencia a 
varios patogenos, entre ellos a las especies Pseudomonas syringae y P. 
tabaci.    Tambien se han obtenido plantas transgenicas de tabaco 
resistentes a P. syringae   mediante insercion de un gen quimerico que 
detoxifica a la toxina del patogeno, la tabtoxina, construido a partir 
del gen de resistencia de la propia bacteria.




Desde que se comprobo que la expresion constitutiva en plantas 
transgenicas de genes que codifican una quitinasa y una proteina 
inactivadora de ribosomas conferia proteccion parcial contra ataques de 
hongos, un largo repertorio de genes ha sido identificado para su 
posterior manipulacion. Ademas, estan apareciendo estrategias para la 
manipulacion de defensas multigenicas, tales como la deposicion de 
lignina y la sintesis de antibioticos del tipo de las fitoalexinas.  
Esto se realiza mediante:  (i) la sobre-expresion de genes que codifican 
pasos en las rutas metabolicas que determinan la tasa de produccion;  
(ii) la modificacion de los factores de transcripcion o de otros genes 
reguladores, y; (iii)  la creacion de nuevas fitoalexinas por medio de 
la transferencia interespecifica de genes biosinteticos.






d) Tolerancia al estres ambiental.


Se ha trabajado intensivamente para tratar de transferir las abundantes 
resistencias al estres presentes en especies silvestres a las 
cultivadas, tanto por tecnicas tradicionales como por ingenieria 
genetica. Sin embargo, se requiere mayor conocimiento de las bases 
fisiologicas, bioquimicas y geneticas de las respuestas de las plantas 
al  ambiente para progresar significativamente en este area. Pese a 
ello,  han sido identificados genes inducidos por calor, frio, salinidad 
y metales pesados. Queda por determinar el papel de estos genes en la 
proteccion real de la planta frente al estres. Una perspectiva 
interesante en la manipulacion genetica de las resistencias a la 
sequedad y a la salinidad es la acumulacion de osmoprotectores, 
compuestos organicos que incrementan la concentracion de solutos  (y en 
consecuencia  el contenido en agua)  en la celula, sin interferir con 
sus procesos metabolicos.  Existen varios candidatos en plantas 
superiores, tales como la prolina, el pinitol, el beta-
dimetilsulfoniopropionato, la glicina betaina, la prolina betaina, y la 
alanina betaina.  La manipulacion de genes implicados en el metabolismo 
de estos compuestos, de modo que se provoque una acumulacion de 
osmoprotectores en la planta, esta recibiendo la atencion de varios 
grupos de investigacion.




Se han obtenido plantas transgenicas de nabo y tabaco, portadoras de un 
gen de origen humano que codifica una proteina pequen~a capaz de unirse 
a metales pesados, la metalotioneina, secuestrandolos y disminuyendo su 
toxicidad. Estas proteinas estan presentes en vertebrados y en hongos. 
Las plantas transgenicas muestran  tolerancia a niveles toxicos de Cd y 
esta se hereda de forma estable.  Otros intentos de producir plantas 
tolerantes a los metales a traves de seleccion de cultivos in vitro  no 
han tenido gran exito. Aunque se obtienen lineas celulares resistentes a 
Al, Hg, Zn, Cd, y otros metales, solo en unos pocos casos el nuevo 
caracter se ha expresado de forma estable en plantas regeneradas de 
tales celulas. Por otra parte, los ecotipos tolerantes a altas 
concentraciones de iones toxicos, encontrados en zonas mineras y 
susceptibles de ser utilizadas en programas de mejora, muestran una tasa 
de crecimiento muy baja.  Por ello, parece que la ingenieria genetica 
puede ser la tecnica mas adecuada para conseguir  plantas con este tipo 
de resistencias. 






e) Produccion de formas androesteriles.


Se han encontrado dos genes de ribonucleasa que selectivamente destruyen 
el linaje de celulas tapetales durante el desarrollo de las anteras. Una 
ribonucleasa  procede de Aspergillus oryzae  y la otra de Bacillus 
amyloliquefaciens  (llamada Barnasa).  Tras la construccion de genes 
quimericos de ambas ribonucleasas, que son expresados especificamente en 
las anteras, se han obtenido plantas transgenicas  de tabaco y colza. La 
expresion de estos genes afecta a la produccion de polen funcional y 
viable, obteniendose plantas androesteriles. Este gen nuclear es 
dominante y su expresion en la antera destruye selectivamente la capa de 
celulas tapetales que rodea al saco de polen.  La capacidad de los genes 
de ribonucleasas como inductores de esterilidad masculina proporciona 
una nueva estrategia para la produccion de hibridos.  Acoplando el gen 
quimerico a un gen dominante de resistencia a herbicida  pueden 
disen~arse sistemas de mejora encaminados a seleccionar poblaciones 
uniformes de plantas androesteriles. En plantas cultivadas en las que el 
fruto no es la parte almacenada (por ejemplo, lechuga, zanahoria, col), 
la plantas androesteriles  pueden cruzarse con cualquier linea 
polinizadora para producir semillas hibridas. Por el contrario, en otros 
cultivos como el tomate, trigo, arroz o maiz sera necesario restaurar 
completamente la fertilidad masculina en la descendencia. La tecnologia 
del ARN antisentido  y la existencia del barstar, una proteina 
inhibidora de la barnasa, pueden hacer posible el desarrollo de 
estrategias para la restauracion de la fertilidad masculina.




f)  Maduracion del fruto.


La manipulacion del metabolismo de las plantas con el fin obtener 
incrementos en la produccion de algunos compuestos (p. ejem. 
carbohidratos, proteinas), o el control de la sintesis de otros,  tiene 
aplicaciones en diversas areas tales como el desarrollo de  productos 
alimenticios  mas nutritivos y menos costosos.    El etileno (C2H4) 
controla la maduracion del fruto. La expresion de un ARN antisentido  
del enzima regulador de la sintesis de etileno, la 1-aminociclopropano-
1-carboxilato sintetasa, inhibe la maduracion del fruto en plantas de 
tomate. La administracion de etileno o propileno exogenos elimina el 
efecto inhibitorio.    Genes que codifican otros enzimas implicados en 
el proceso de maduracion del fruto, como la poligalacturonasa, que 
participa en la degradacion de componentes de la pared celular,  han 
sido manipulados e introducidos en plantas de tomate con el fin de 
estudiar sus efectos sobre la textura del fruto.  Estos abordajes 
permiten obtener variedades  transgenicas donde el proceso de maduracion 
sea uniforme y facilmente controlable,  paliando las perdidas debidas a 
la sobre-maduracion producida durante el transporte o las deficiencias 
en la refrigeracion de frutas y verduras.


El potencial de la tecnologia antisentido   en la asignacion de 
funciones a las secuencias genicas es enorme. La generacion de plantas 
en las que la produccion de etileno este inhibida, ofrece la oportunidad 
de evaluar el papel del gas en la regulacion de muchos procesos del 
desarrollo vegetal, tales como la senescencia de la hoja, abscision, 
maduracion y respuesta a patogenos; y abre la posibilidad de realizar 
manipulacion genetica para mejorar la calidad, el tiempo de 
almacenamiento y el valor nutricional de muchas plantas y productos 
vegetales.






g) Composicion de acidos grasos.
  
Muchos cultivos producen semillas oleaginosas cuya composicion en acidos 
grasos no es la ideal para el uso al que se destinan. La aplicacion de 
los metodos tradicionales de mejora, reforzados con la mutagenesis 
quimica, ha permitido la obtencion  de nuevas variedades  con 
alteraciones en la composicion de acidos grasos de la semilla, en 
bastante especies.  Son ejemplos destacables las nuevas variedades  de 
colza bajas en acido euricico y las reducciones en los niveles de acidos 
grasos poli-insaturados en soja, girasol y lino (linaza). La mayor parte 
de la variacion genetica en la composicion de acidos grasos en semilla 
parece implicar la presencia de un alelo de un gen que rompe el 
metabolismo normal de acidos grasos y conduce a la acumulacion de 
productos intermedios en los lipidos de la semilla. Sin embargo, parece 
probable que dadas las limitaciones geneticas de este abordaje, muchos 
otros cambios deseables en la composicion de acidos grasos podrian 
requerir la aplicacion directa de los metodos de ingenieria genetica. 
Existen dificultades como por ejemplo las lagunas en el conocimiento de 
la bioquimica y la regulacion del metabolismo de los lipidos (que se van 
enmendando con los estudios exhaustivos en Arabidopsis thaliana ), y el 
hecho de que muchas enzimas claves estan ligadas a membrana, por lo que 
los intentos dirigidos a su solubilizacion y purificacion  no han tenido 
exito.




Se estan disen~ado varias estrategias encaminadas a modificar la 
composicion en acidos grasos de semillas oleaginosas, basadas los  
progresos en el conocimiento de la bioquimica y genetica de la sintesis 
de los lipidos.  A partir de los mutantes actualmente disponibles en 
Arabidopsis   se puede profundizar en el conocimiento de que genes, 
entre los actualmente disponibles provenientes de E. coli  y de 
mamiferos, juegan un papel mas importante en el metabolismo de los 
acidos grasos, de cara a su aislamiento, clonaje e incorporacion al 
genoma de las plantas cultivadas. Aunque la sintesis de acilgliceridos  
participa de rutas relativamente complejas, el conocimiento de su 
bioquimica y, en particular, los analisis con mutantes pueden ser de 
gran utilidad en el disen~o de alteraciones del metabolismo lipidico con 
fines de mejora.






h) Proteinas de semilla.


Las semillas de cereales y legumbres proveen a la poblacion humana del 
70 por ciento de su requerimiento proteico en la dieta. Sin embargo, sus 
deficiencias en aminoacidos esenciales no hacen posible una dieta 
equilibrada basada en estos cultivos, por lo que esta debe ser 
suplementada con aminoacidos de otras fuentes.  Se manejan varias 
estrategias con el objetivo de resolver las deficiencias nutricionales 
de las semillas: (i) insertar aminoacidos adicionales en las proteinas 
ya existentes, o bien sustituirlos por otros mas deseables, (ii) 
introducir proteinas completamente nuevas muy enriquecidas en 
aminoacidos especificos, (iii) transferir genes que codifiquen proteinas 
de reserva conocidas a sistemas pobres en proteinas, y (iv) proveer de 
copias adicionales de genes en sistemas ya productores. Las expectativas 
en este area son moderadamente optimistas, estando la polemica en la 
conveniencia de variar el patron de aminoacidos de un cultivo, o bien 
satisfacer las necesidades proteicas y caloricas combinando diferentes 
cultivos hasta alcanzar los balances dieteticos adecuados. 




Por el momento la mayor parte de los estudios realizados con genes de 
proteinas de semillas en plantas transgenicas han tenido como finalidad 
la identificacion de las regiones que confieren especificidad tisular y  
control temporal a los genes, las secuencias consenso especificas de 
semilla, las secuencias enhancer   y los factores nucleares de union 
(binding);  concentrandose en genes de proteinas de reserva de 
leguminosas y cereales.  Asi, se han obtenido plantas de tabaco y 
petunia con genes de conglicininas (proteina de soja), vicilinas (Pisum 
sativum),  leguminas (P. sativum, Vicia faba, Helianthus annus),   
gluteninas  y hordeinas, de las cuales se ha extraido valiosa 
informacion sobre el control de la expresion de los genes implicados.


Un perspectiva distinta es la produccion de peptidos de interes 
comercial en las semillas de plantas. Factores de liberacion hormonal 
del sistema endocrino de mamiferos, peptidos con funciones 
cardiovasculares o de otro tipo, peptidos con efectos opiaceos,  
peptidos con funciones defensivas en insectos y otros animales, 
anticuerpos funcionales humanos,  entre otros, tienen usos importantes 
en sanidad,  agricultura e industria. A partir de un gen quimerico de 
albumina proveniente de Arabidopsis thaliana   transferido a  la misma 
especie y a Brassica napus,  se ha podido obtener leuencefalina tras un 
pequen~o tratamiento con tripsina.   Por contra, la produccion de 
peptidos en semillas de plantas transgenicas debe competir con las 
biotecnologias fermentativas, por el momento mas desarrolladas.






i) Otros metabolitos de interes alimentario, quimico y farmaceutico.


El incremento de la cantidad de azucares, presentes en ciertos organos o 
tejidos, es un objetivo deseable en la mejora de la calidad de frutas, 
hortalizas y cereales. Se estan realizando esfuerzos para aumentar la 
cantidad de sacarosa de la patata, de fructanos en la achicoria y de 
amilopectina en el trigo mediante tecnologia antisentido.  Tambien se 
estan desarrollando variedades de tomate con alto contenido en solidos y 
alta viscosidad en el fruto, consecuencia de la acumulacion de pectina.  
La introduccion del gen de una proteina de sabor dulce, llamada 
monelina,  es util en la obtencion de nuevas variedades de tomate y 
lechuga con mejor sabor.




Las plantas son una fuente tradicional de materiales monomericos y 
polimericos, p. ej. azucares, acidos grasos, almidones, celulosas, 
caucho y ceras.  En la busqueda de nuevos materiales biologicos 
renovables la ingenieria genetica de plantas puede jugar un importante 
papel. La composicion del almidon en patatas, maiz y trigo tambien esta 
siendo modificada con el fin de que pueda ser utilizado en la industria 
papelera o en la fabricacion de plasticos biodegradables.  La presencia 
y expresion del gen de manitol- deshidrogenasa de E. coli   incrementa 
la concentracion de manitol en plantas transgenicas de tabaco.  La 
introduccion del gen bacteriano de la clodextrin-glucosil transferasa en 
la patata produce niveles bajos, pero detectables, de ciclodextrinas en 
tuberculos.  Recientemente se han obtenido plantas transgenicas que 
expresan  acetoacetil-CoA sintetasa y acetoacetil-CoA reductasa que 
cataliza dos pasos en la produccion de poli-beta-hidroxibutirato, un 
polimero termoplastico biodegradable. Tambien se esta ensayando la 
expresion de esterasas de plantas tropicales en cultivos de zonas 
templadas como soja y colza, los cuales podrian producir acidos grasos 
de 12 carbonos.




Se ha conseguido la produccion correcta de inmunoglobulinas gamma y 
kappa, y el ensamblaje de anticuerpos funcionales de forma muy eficiente 
en hojas de plantas de tabaco, obtenidas a partir del cruce entre 
plantas transgenicas que expresaban el gen de una sola cadena de 
inmunoglubina. El ensamblaje de subunidades  mediante cruzamiento sexual 
puede ser un metodo de aplicacion general para la expresion de 
multimeros heterologos en plantas.  Ya que grandes moleculas como las  
proteinas multimericas no atraviesan las paredes celulares vegetales, la 
union mediante anticuerpos de pequen~as moleculas organicas (toxinas, 
herbicidas, hormonas, quelatos organicos, por ejemplo) que son 
permeables en la pared celular, podria ser un buen metodo para retener 
estas moleculas en la plantas. La acumulacion de anticuerpos funcionales 
puede proporcionar nuevas opciones para la recuperacion de muchos 
contaminantes y otras moleculas organicas de significacion biologica.  
La produccion de compuestos farmaceuticos como encefalinas en  soja y 
seroalbumina humana en  patata,  permite prever que otras proteinas como 
neuropeptidos, factores de coagulacion sanguinea y hormonas del 
crecimiento puedan ser producidas en semillas  y en otros organos de la 
planta de forma rentable.  Los virus bacterianos podrian ser vectores de 
alto nivel de expresion debido a su elevado numero de copias.






j) Color en plantas ornamentales.


Los pigmentos florales son productos de la ruta biosintetica de los 
flavonoides. Mediante la tecnologia del ARN antisentido  en el gen de la 
chalcona- sintetasa se ha podido manipular la pigmentacion floral  en 
plantas transgenicas de Petunia.  Algunos transformantes han mostrado 
variaciones en el patron de formacion de pigmentos (sectores, anillos, 
etc.). Las aplicaciones de estas tecnicas en la produccion de nuevas 
variedades de plantas ornamentales son evidentes.






k) Fijacion del Nitrogeno.


El crecimiento de los cultivos agricolas depende del enorme aporte de 
nitrogeno utilizable, bien suministrado en forma mecanica como amonio, 
urea o nitratos, o bien producido naturalmente en el suelo mediante la 
reduccion microbiana del nitrogeno atmosferico. Este aporte natural se 
consigue mediante estrechas asociaciones entre las plantas y los 
microorganismos fijadores del nitrogeno. Entre las plantas cultivadas 
solo las leguminosas tienen esa capacidad,  por asociacion simbiotica en 
sus raices con especies de Rhizobium.  Los campos de manipulacion 
genetica  se centran en: (i) la ampliacion del espectro de huespedes de 
Rhizobium  a cereales y forrajeras, (ii) la proteccion de la nitrogenasa 
frente al oxigeno, y (iii) el uso de cloroplastos como posible organulo 
diana donde transferir los genes de fijacion del nitrogeno.  La 
dificultad en la consecucion de estos objetivos no debe ser subestimada, 
y pese a que el alto coste de produccion de los fertilizantes esta 
estimulando la investigacion en estas areas, es probable que aun pase 
algo de tiempo hasta ver sus resultados en agricultura. Por el momento 
ya se han obtenido cepas recombinantes de Rhizobium  mas eficientes como 
fijadoras de nitrogeno  que son inoculadas en algunas leguminosas.






l) Incremento de la eficacia fotosintetica.


El valor ultimo de las plantas esta en su capacidad para convertir la 
energia solar en reservas quimicas almacenables, a traves del proceso de 
la fotosintesis. Las estrategias para incrementar su eficiencia de 
utilizacion de la energia solar sin dos: (i) la modificacion de los 
genes que codifican las subunidades de la Ribulosa Bifosfato 
Carboxilasa,  con el fin de producir un enzima que proporcione una 
fijacion mas eficiente del CO2, y (ii) el intercambio de varios 
componentes de fotosistemas entre plantas diferentes, con el fin de 
optimizar el transporte de electrones. El numero y la complejidad de las 
reacciones fotosinteticas, pese a hacer muy excitante su manipulacion 
genetica, probablemente retrasara su aplicacion practica. Se han 
obtenido plantas transgenicas de tabaco y tomate que incorporan un gen 
quimerico del fitocromo tipo I (que normalmente solo se acumula durante 
la noche), cuya presencia provoca cambios morfologicos, tales como 
enanismo, follaje verde oscuro, hojas mas pequen~as y mas anchas, 
dominancia apical reducida, altos niveles de sintesis de antocianinas en 
semillas, entre otras. El fenotipo segrega normalmente en la 
descendencia.  Los cambios morfologicos inducidos por la presencia de un 
fitocromo tipo I en tejido en crecimiento diurno, son una primera sen~al 
del papel que la ingenieria genetica puede jugar en la alteracion de los 
procesos metabolicos fotosinteticos.






Perspectivas.


El potencial de las tecnicas de ingenieria genetica como herramientas en 
manos del mejorador de cultivos parece vasto. Como ejemplos de los 
logros  ya obtenidos  se pueden mencionar las variedades de pepinos, 
tomates y patatas resistentes a virus, las nuevas variedades de flores 
obtenidas por tecnicas in vitro,  la transferencia de resistencias a 
insectos en algunas hortalizas, nuevas variedades horticolas capaces de 
crecer con menores cantidades de fertilizantes, Rhizobium  recombinantes 
que mejoran la capacidad de fijacion de nitrogeno de las legumbres, e 
incluso plantas transgenicas de tabaco que producen anticuerpos 
funcionales. Los progresos obtenidos en este area durante los ultimos 8 
an~os hacen pensar en un futuro cada vez mas satisfactorio (cuadro 2).


La principal limitacion en la aplicacion de la ingenieria genetica a la 
agricultura esta en el necesario conocimiento basico de los componentes 
geneticos responsables de las caracteristicas de las plantas y de los 
mecanismos de su regulacion y expresion. A pesar de que los metodos de 
introduccion y expresion de genes exogenos en plantas se han 
perfeccionado mucho en diez an~os, los ingenieros geneticos de plantas 
carecen aun de importantes herramientas comunes en los sistemas 
microbianos.  Las nuevas combinaciones geneticas introducidas en plantas 
pueden expresarse constitutivamente,  hacerlo bajo el control de 
secuencias reguladoras en un determinado tejido u organo de la planta   
y/o a partir de un momento determinado del desarrollo, o bien estar 
regulados bajo el efecto de agentes inductores de tipo fisico (induccion 
por herida, calor, frio) o quimico (insecticidas, herbicidas).


Si bien desde hace varios an~os se vienen describiendo promotores 
especificos de tejido, e inducibles por herida, esta en sus comienzos la 
capacidad de regular la expresion de los transgenes mediante agentes 
quimicos: la induccion genica de tipo quimico. Basicamente se busca el 
aislamiento de una secuencia en cis  que opere como llave reguladora de 
un gen con el que esta naturalmente asociado, seguido de la asociacion 
de esta secuencia cis   al gen de interes   De este modo se obtiene la 
expresion del gen manipulado de manera similar al gen natural  regulado 
quimicamente.   Pueden  distinguirse dos formas basicas de regulacion 
quimica de genes: (i) los sistemas endogenos, que usan sen~ales 
reguladoras de los propios genes de plantas en respuesta al tratamiento 
quimico sintetico; y (ii) los sistemas exogenos, que recaen en elementos 
provenientes de genes de otros reinos, asociados a compuestos quimicos 
que no tienen efecto en la expresion de los genes nativos de plantas.  
Las secuencias reguladoras de tipo endogeno son atractivas ya que pueden 
ser de facil manipulacion. Por ejemplo, la adicion de un elemento 
promotor 5U puede ser suficiente para controlar una secuencia 
codificante externa. Sin embargo, el uso de secuencias reguladoras 
endogenas implica que otros genes nativos puedan estar ligados a esas 
secuencias reguladoras, por lo que pueden ser inducidos al an~adir el 
regulador quimico.


Han sido hallados varios ejemplos de sistemas de regulacion quimica por 
induccion, algunos implicados en los mecanismos de resistencias de las 
plantas. Los compuestos de inmunizacion son agentes quimicos que inducen 
la respuesta del sistema de resistencia adquirida (SAR)   en plantas. El 
SAR es un sistema de resistencia de amplio espectro que es inducido por 
una infeccion patogenica inicial o mediante tratamiento quimico. Los 
inductores quimicos pueden ser de origen natural, como el acido acetil-
salicilico, o de tipo sintetico, como el acido 2,6-dicloroisonicotinico 
(INIA).  La induccion conduce a la expresion de al menos nueve juegos de 
genes en tabaco, la especie mejor caracterizada. La region promotora de 
uno de ellos (la proteina PR, pathogenesis -related protein )  confiere 
expresion inducible de tipo quimico a un gen testigo, que se expresa por 
la presencia de acido acetil-salicilico, INIA, e incluso de la proteina 
insecticida de Bacillus thuringensis.   El interes practico de este tipo 
de induccion es enorme.


El tipo de caracteres que han sido introducidos en plantas transgenicas 
hasta la actualidad es muy limitado. Mientras que muchos de esos 
caracteres funcionan bien bajo expresion constitutiva, otros solo seran 
de utilidad si son regulados. Mientras que las bases bioquimicas y 
geneticas de los procesos mas complejos de las plantas son descubiertos, 
es probable que se vayan creando un numero creciente de transgenes 
utiles unicamente bajo control exogeno. El uso de sistemas de regulacion 
quimica, junto a los de tipo fisico y a las secuencias promotoras y/o 
reguladoras 5U y 3U  que definen la expresion espacial y temporal de los 
genes,  conducira al desarrollo de fenotipos mas utiles en las especies 
de interes agricola.








Metodos para introducir genes en plantas.


La aplicacion de las tecnicas de ingenieria genetica trasciende los 
conceptos de la mejora genetica tradicional  al no limitarse a 
introducir o manipular caracteres de valor agronomico, tales como el 
control de insectos, malas hierbas, y enfermedades de las plantas, o la 
calidad de los productos agricolas.  Debido a su capacidad para crear 
combinaciones geneticas totalmente nuevas y de manipular y dirigir su 
expresion temporal y espacial, la ingenieria genetica permite 
desarrollar plantas transgenicas cuyos productos  pueden tener interes 
para las industrias  agroalimentarias, quimicas y  farmaceuticas. El uso 
agricola de germoplasma recombinante de elite, capaz de producir 
compuestos de alto valor an~adido, puede suponer una alternativa a los 
usos agricolas tradicionales  y traer consigo  ventajas  
medioambientales con respecto a la sintesis quimica tradicional. 


La base de la mejora genetica vegetal es la transferencia de informacion 
genetica entre plantas con el fin de producir los fenotipos deseados. La 
tecnologia del DNA recombinante permite la manipulacion directa y 
altamente especifica del material genetico. Las situaciones en las que 
las tecnicas del DNA recombinante pueden resultar mas valiosas son 
aquellas que implican la transferencia de genes unicos o de pequen~os 
grupos de genes de un organismo a otro, cuando tal transferencia no sea 
posible por medios tradicionales. Ademas de incorporar genes de interes 
provenientes de otra especie vegetal, microbiana o animal, se pueden 
manipular in vitro  los genes propios de una especie para,  por ejemplo,  
alterar su nivel de expresion,  el momento de activacion, o  modificar 
la especificidad tisular de sus productos con un fin determinado.  
Tambien es posible la inactivacion selectiva de los genes mediante la 
transcripcion de genes antisentido , y se esta en camino de lograr la 
insercion de genes de manera mas especifica con el fin de minimizar la 
variabilidad en la expresion genica entre los transformantes. 






Las primeras plantas que expresaron genes manipulados fueron plantas de 
tabaco, Nicotiana tabacum,  transformadas mediante vectores de A. 
tumefaciens.  La transformacion fue confirmada por la presencia de 
secuencias de DNA externas en los transformantes primarios y en su 
progenie, y por un fenotipo de resistencia antibiotica conferida por un 
gen quimerico de neomicina fosfotransferasa. Estos primeros experimentos 
de transformacion a menudo utilizaron protoplastos como celulas 
receptoras. El posterior desarrollo de metodos de transformacion basados 
en explantes regenerables como hojas, brotes y raices contribuyeron 
significativamente a la transformacion facil y rutinaria que se usa hoy 
en muchas especies de dicotiledoneas, mostrandose las monocotiledoneas 
muy reticentes a la transformacion con este sistema.  Por ello, varios 
metodos de transformacion con DNA libre como la microinyeccion, 
electroporacion, y la tecnologia del disparo de particulas, han sido 
desarrollados con exito para la transformacion en monocotiledoneas como 
el maiz, trigo y arroz.  En la actualidad mas de 50 especies de plantas 
cultivadas pueden ser manipuladas geneticamente por tecnicas  
moleculares. La lista incluye practicamente todas las dicotiledoneas mas 
importantes y esta aumentando rapidamente el numero de monocotiledoneas. 
En los proximos an~os se preve la puesta a punto de sistemas eficaces y 
rutinarios de transformacion para practicamente todos los cultivos.








Transferencia de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens.


Los derivados del patogeno A. tumefaciens   han mostrado ser vehiculos 
eficientes y versatiles para la introduccion de genes en plantas y 
celulas vegetales.  Los primeros experimentos demostraron que DNA 
heterologo insertado en el DNA-T podia ser transferido a las plantas 
junto con los genes del DNA-T ya existentes. Se construyeron sistemas de 
transformacion eficientes eliminando los genes de la biosintesis de 
fitohormonas de la region del DNA-T, lo que terminaba con la capacidad 
de la bacteria para inducir proliferacion celular aberrante.  Los 
modernos vectores de transformacion son capaces de replicacion en 
Escherichia coli  y en A. tumefaciens,   tras las manipulaciones 
convenientes. Los avances mas recientes en la tecnologia de los vectores 
de Agrobacterium  han implicado mejoras en la ordenacion de genes y 
sitios de restriccion en los plasmidos, para facilitar la construccion 
de nuevos vectores de expresion. Los vectores que se usan actualmente 
contienen regiones multilinker   que  pueden estar flanqueadas por un 
promotor y/o un sitio de adicion de poliadenilato, para hacer posible la 
expresion directa de las secuencias codificantes insertadas.






Basicamente se emplean dos tipos de vectores desarrollados a partir del 
sistema A. tumefaciens - plasmido Ti: los llamados vectores de 
cointegracion (sistemas cis) y los vectores binarios (sistemas trans ).
En el primer caso se clona en propio segmento DNA-T en Escherichia coli 
(utilizando por ejemplo el plasmido pBR322). El DNA-T del plasmido 
aislado se abre con enzimas de restriccion adecuados, lo que permite la 
introduccion de segmentos del DNA extran~o que se desea transferir al 
genoma de la planta. Los recombinantes se vuelven a clonar en E. coli.  
Cuando estos plasmidos son introducidos por conjugacion en una cepa de 
A. tumefaciens   portadora del pTi salvaje, la recombinacion homologa 
dentro de las celulas permite la transferencia del segmento de DNA-T que 
contiene el inserto a la region DNA-T del pTi completo. Incorporando un 
marcador de seleccion al inserto, por ejemplo el gen de resistencia a la 
kanamicina de E. coli,   las celulas de A. tumefaciens   portadoras del 
pTi recombinante pueden ser seleccionadas facilmente. La replicacion del 
pTi recombinante en A. tumefaciens,  seguida de la infeccion a plantas, 
da lugar a la proliferacion de celulas vegetales transformadas que 
constituyen primero un callo, y alterando de la forma adecuada las 
concentraciones de fitohormonas, puede regenerarse la planta transgenica 
completa.  El vector binario aprovecha la distincion entre funciones cis  
y trans  que existe en el plasmido. El vector basico es un plasmido 
lanzadera, capaz de replicarse en E. coli  y en un amplio rango de otras 
bacterias (incluyendo A. tumefaciens ), que contiene los dos segmentos 
de 24 pb correspondientes a los limites del DNA-T.  En E. coli ,  
mediante procedimientos rutinarios  de clonaje, se preparan derivados 
del vector que contienen inserciones de DNA (secuencia que se desea 
transferir a la planta) hacia la izquierda del segmento de 24 pb de la  
derecha.  Estos  plasmidos recombinantes son trasferidos directamente a 
celulas de A. tumefaciens  de una cepa portadora del pTi de tipo salvaje 
(o mejor aun, de un pTi defectuoso al que se haya eliminado las 
secuencias de 25 pb o del segmento DNA-T completo).  Los plasmidos 
recombinantes son capaces de replicarse en el nuevo hospedador, el cual 
le proporciona en trans   las funciones vir   requeridas  para la 
insercion del DNA en el genoma de la planta.  Las celulas vegetales que 
son posteriormente infectadas por estas bacterias recombinantes 
contienen copias integradas del DNA-T salvaje, del DNA-T recombinante o 
de ambos. En el caso de haber empleado el pTi defectuoso unicamente son 
trasferidos los DNA-T recombinantes lo que supone una ventaja. Si se 
asocia al DNA-T recombinante un gen marcador y una secuencia de 
regulacion de la transcripcion que sea activa en la planta (por ejemplo, 
la region 3U del gen nos )  puede expresarse el producto genico 
funcional correspondiente en la planta transgenica.




Agrobacterium  constituye un excelente sistema de introduccion de genes 
en celulas vegetales, ya que: (i) el DNA puede ser introducido en todos 
los tejidos de la planta, lo que solventa la necesidad de protoplastos; 
y (ii) la integracion del DNA-T es un proceso relativamente preciso. La 
region de DNA a ser transferida esta definida por las secuencias 
flanqueantes. Ocasionalmente se producen reordenaciones, pero en la 
mayor parte de los casos la region se inserta intacta en el genoma de la 
planta. La estabilidad de la expresion de la mayoria de los genes que se 
introducen via Agrobacterium  es excelente. Los DNA-T integrados 
muestran mapas geneticos consistentes y segregaciones adecuadas. Los 
caracteres introducidos han mostrado ser estables durante muchas 
generaciones de cruzamientos en plantas manipuladas por estas tecnicas. 
Esta estabilidad es critica de cara a la comercializacion de plantas 
transgenicas. La lista de especies que pueden ser transformadas por 
Agrobacterium  se amplia dia a dia, y en el momento presente incluye a 
bastantes de los cultivos mas importantes, exceptuados los cereales.






Pocas monocotiledoneas parecen ser hospedadores naturales de 
Agrobacterium,  aunque se han obtenido plantas transgenicas en 
esparragos con vectores Agrobacterium  y se han observado tumores 
transformados en la batata.  Cereales de grano como el arroz, maiz y 
trigo no han sido transformados de forma estable con Agrobacterium,  a 
pesar de la evidencia de transferencia de T-DNA en maiz, trigo y cebada. 
Por ello se han realizado esfuerzos extensivos para conseguir 
tecnologias de transformacion alternativas en estas especies.




Vectores virales y agroinfeccion.


Los virus DNA de plantas han recibido bastante atencion como posibles 
vectores para la introduccion de genes en las plantas. Se ha demostrado 
la propagacion y expresion de genes bacterianos, seleccionables como 
marcadores, trasferidos a plantas por el virus del mosaico de la 
coliflor, CaMV.   Tambien se han combinado las capacidades de los 
plasmidos derivados del Ti y de los vectores virales en una tecnica 
llamada RagroinfeccionS:  DNA virico o copias cDNA del ARN virico se 
introducen en plantas mediante plasmidos Ti de Agrobacterium , 
resultando una infeccion virico sistemica en la planta transgenica. Para 
la liberacion del virus no es necesario que el DNA-T se integre en el 
genoma de la planta. La infeccion sistemica no es prueba de integracion 
del DNA externo. Sin embargo, en caso de producirse la integracion, la 
agroinfeccion conduce a la transformacion de las celulas adyacentes a la 
herida y, en consecuencia, a la posible obtencion de plantas 
transgenicas.


Los virus ARN como el virus del mosaico del tabaco, TMV,  que  replican 
solo a traves de intermediarios DNA, pueden tambien ser utilizados como 
vectores en ingenieria genetica de plantas. Los vectores  virales  
proporcionan algunas ventajas  teoricas para  la introduccion de genes 
en plantas, como son la facilidad de la infeccion, el rango de 
hospedadores mas amplio al de Agrobacterium,  y el alto cociente entre 
el numero de copias y la expresion de genes insertados bajo el control 
de los promotores apropiados. Sin embargo existen de hecho limitaciones 
importantes:  (i) el taman~o maximo del DNA pasajero que no afecta a la 
infectividad virico parece estar limitado; (ii) las infecciones virales 
generalmente provocan sintomas especificos de enfermedad o son letales 
para la planta huesped; (iii) posiblemente, la alta frecuencia de 
errores durante la sintesis del ARN virica puede dar lugar a la 
expresion incorrecta del gen introducido; y, la mas importante; (iv) el 
DNA externo no se transfiere necesariamente a la descendencia.   De 
acuerdo con las evidencias disponibles, los virus no se integran en el 
genoma de la planta hospedadora, y no aparecen en los meristemos de la 
planta por lo que no se transmiten a la descendencia por via sexual.  
Parece muy dificil (excepto, p. ej. a traves de elementos transponibles) 
el uso de vectores virales para la transformacion genetica de plantas. 
pero tienen un buen potencial para la amplificacion genica y la 
infeccion sistemica en plantas individuales.


Se han propuesto otros posibles vectores para la transformacion genetica 
en celulas vegetales, tales como elementos transponibles, elementos 
mitocondriales del maiz, componentes genomicos nucleares, y viroides y 
virusoides, que, por el momento, no han mostrado eficiencia.






Transferencia directa de genes.


El  desarrollo de estos metodos se hizo inspirandose en las tecnicas 
fisicas usadas en la transformacion de celulas animales en cultivo. Asi 
se ha conseguido la transformacion de protoplastos de plantas 
facilitando la entrada de DNA por precipitacion con fosfato calcico, 
tratamiento con PEG, electroporacion, o la combinacion de varios de 
estos tratamientos.  Tales metodos han posibilitado la produccion de 
celulas transgenicas para estudios de expresion genica en sistemas que 
no pueden ser transformados por otras tecnicas. La aplicacion de estas 
tecnicas a la produccion de plantas transgenicas esta limitada por las 
dificultades inherentes a la regeneracion de plantas a partir de 
protoplastos. Ha habido considerables avances  en la regeneracion de 
cereales, tradicionalmente uno de los grupos mas recalcitrantes. Varios 
laboratorios han tenido exito en la regeneracion de plantas fertiles de 
arroz a partir de protoplastos de embriones. Este avance fue 
inmediatamente seguido por la produccion de plantas transgenicas de 
arroz, a traves de la descarga de DNA libre en protoplastos y posterior 
regeneracion de la planta, primero en variedades Japonica  y 
recientemente en una variedad Indica  (la mas importante como fuente de 
alimento en el mundo)..  En maiz se han obtenido plantas transgenicas 
fertiles a traves de tecnicas de electroporacion de embriones inmaduros 
y de calli, tambien en lineas comerciales.




En paralelo al trabajo de transformacion de protoplastos se han 
realizado esfuerzos para encontrar nuevas vias de introducir DNA en 
celulas intactas o tejidos. La regeneracion de cereales a partir de 
embriones inmaduros o de explantes es relativamente una rutina. Uno de 
los avances mas significativos en este area ha sido la introduccion de 
la tecnologia de los microproyectiles de alta velocidad. En este sistema 
el DNA se carga sobre una superficie de pequen~as particulas de metal 
(0+5 a 5 micras) que son aceleradas a velocidades de uno a varios 
centenares de metros por segundo. Las particulas son capaces de penetrar 
a traves de varias capas de celulas y realizan la transformacion celular 
en tejidos de explantes. Se han obtenido plantas transformadas estables 
de tabaco y soja mediante disparo de particulas y, mas recientemente,  
plantas transgenicas fertiles de maiz, arroz, trigo y avena mediante 
bombardeo de cultivos embrionarios y de embriones cigoticos inmaduros. 
Gracias a la eliminacion del paso por el estado de protoplastos, el 
metodo del disparo tiene el potencial de permitir la transformacion 
directa de genotipos comerciales de cereales.  Una desventaja de los 
sistemas de transferencia directa es la frecuente aparicion de 
reordenaciones y reacciones de concatenacion antes de la insercion del 
gen, lo que determina un patron de integracion bastante impredecible.








Protoplastos y transferencia directa de genes.




Los protoplastos incorporan eficazmente DNA del medio si se les trata 
con polietilenglicol (PEG) y/o electroporacion. El propio proceso de 
aislamiento de protoplastos probablemente induce la formacion de celulas 
competentes en el estado adecuado. Si se dispone de poblaciones de 
protoplastos que contengan celulas competentes, el DNA exogeno es 
integrado facilmente via recombinacion no-homologa. Tambien puede 
ocurrir recombinacion homologa pero a un nivel mas bajo. Cuando se 
transforman protoplastos capaces de regeneracion, pueden obtenerse 
plantas transgenicas  que contienen, expresan y heredan de forma estable 
el gen extran~o. En cereales, solo se han aislado protoplastos 
competentes a partir de suspensiones embriogenicas establecidas a partir 
de tejidos inmaduros (escutelo, base de la hoja, antera). Los 
procedimientos standard de transferencia de genes con protoplastos han 
conducido a la regeneracion de varios cereales transgenicos (arroz, 
maiz). El cultivo de protoplastos aislados a partir de diferentes 
tejidos es util en los analisis de la expresion transitoria de un gen o 
de una secuencia reguladora, ya que la incorporacion del DNA a esos 
protoplastos no es problematica. La integracion, en caso de producirse, 
no tiene consecuencias, ya que los protoplastos de este origen no 
proliferan.  




La fusion de protoplastos, mediada por varios agentes fusogenos como el 
PEG, es un buen metodo para la generacion de hibridos interespecificos. 
El DNA-T de Agrobacterium  y otras secuencias de DNA puede ser 
transferidas de una especie a otra por medio de la fusion de 
protoplastos y esferoplastos. Con el desarrollo de los marcadores 
adecuados, la fusion de protoplastos supone una via de control del 
intercambio de genes entre especies, por medio de la cotransferencia de 
estos con genes marcadores seleccionables derivados del vector.








Fusion de liposomas con tejidos y protoplastos.


Entre los distintos metodos para introducir DNA aislado en protoplastos 
y tejidos de plantas superiores, la transferencia directa de genes 
mediada por liposomas es uno de los mas dificiles. Si bien en un 
principio el metodo mostro ser eficaz, solo ha recibido una atencion muy 
limitada. Los problemas radican en la preparacion de los liposomas y en 
la encapsulacion de los plasmidos. Estos problemas quedan en parte 
soslayados con la reciente disponibilidad comercial de preparaciones de 
liposomas estables (Lipofectina), que espontaneamente se unen al DNA y 
median en su descarga dentro de la celula. La eficacia del metodo 
aumenta al combinarlo con otras tecnicas como el tratamiento con PEG o 
la electroporacion. La descarga de DNA y otras macromoleculas en 
protoplastos vegetales mediante diferentes tipos de liposomas ha sido el 
objetivo de muchos experimentos, habiendose conseguido en primer lugar 
la integracion de DNA exogeno en el genoma de maiz  y de tabaco.






Los metodos de transferencia mediados por liposomas poseen algunas 
ventajas con respecto a la transferencia directa de DNA, como son la 
proteccion contra las nucleasas que proporciona la membrana y la no 
necesidad de un DNA transportador (carrier).   Por contra, la breve 
sonicacion necesaria para la inclusion del DNA en los liposomas puede 
producir rupturas y dan~os.  Pese a su dificultad, el metodo de fusion 
de liposomas que contienen DNA con protoplastos esta actualmente bien 
asentado en la produccion de plantas transgenicas de bastantes especies.  
Menos exitosa ha resultado la fusion de los liposomas  con tejidos y 
celulas normales.








Disparo de particulas o Biolistica.


El bombardeo de microproyectiles presenta el mayor potencial para la 
transformacion de cereales. Por medio de esta tecnica se han obtenido 
plantas transgenicas en monocotiledoneas como maiz, arroz, trigo, avena 
y can~a de azucar, ademas de varias dicotiledoneas: soja, tabaco, 
algodon.  La aceleracion de particulas pesadas  (tungsteno u oro) 
recubiertas de DNA puede usarse para transportar genes dentro de celulas 
y tejidos vegetales. Las ventajas de este metodo le dan un potencial de 
aplicabilidad general: (i)   tecnicamente es facil de manejar; (ii)  un 
disparo puede producir multiples integraciones; (iii) las celulas pueden 
sobrevivir a la introduccion de una particula, e incluso de varias; (iv) 
los genes que recubren la particula recuperan su actividad biologica; 
(v)  las celulas diana pueden ser de diversos tipos, tales como polen, 
cultivos celulares, organos y meristemos; (vi) las particulas tambien 
alcanzan capas celulares mas profundas. De este modo, el metodo 
proporciona un sistema de descarga de DNA independiente de vectores en 
una gran variedad de tipos celulares. La tecnica, sin embargo, presenta 
algunos problemas inherentes. Ya que los eventos de expresion 
transitoria de genes introducidos por esta tecnica se producen con una 
frecuencia de 10-4, y la integracion efectiva de estos genes en el 
genoma de la planta lo hace con una frecuencia de 10-8, se requieren 
grandes numeros para alcanzar con exito una celula vegetal competente. 
Ello hace necesario un esfuerzo en la optimizacion de los parametros de 
la tecnica para mejorar la situacion. Ademas, las particulas tienen que 
alcanzar celulas competentes, generalmente escasas salvo en cultivos 
celulares embriogenicos. El bombardeo de meristemos, que ha sido exitoso 
en el caso de la soja,  plantea muchos mas problemas en los cereales. La 
obtencion de cultivos embriogenicos en cereales ha abierto las puertas a 
la aplicacion rutinaria de esta tecnica en este tipo de plantas.






El bombardeo con microproyectiles desnudos tambien ha sido utilizado 
para producir heridas en las celulas  y favorecer  la posterior 
transferencia de genes mediada por A. tumefaciens,  incrementandose en 
al menos 100 veces la obtencion de celulas recombinantes  en meristemos 
de tabaco y girasol, respecto a las tecnicas standard.






Microinyeccion.


La microinyeccion es una de las tecnicas mas precisas para la descarga 
de macromoleculas dentro de compartimentos intracelulares especificos. 
Usando estos metodos se ha conseguido la transformacion de protoplastos 
de alfalfa y de tabaco, y la obtencion de clones transgenicos  a partir 
de protoplastos y quimeras transgenicas en embriones de colza. La 
microinyeccion intranuclear ofrece la gran ventaja de poder transformar 
protoplastos individuales a altas frecuencias. Ademas, el hecho de que 
junto al DNA desnudo puedan inyectarse otros elementos geneticos como 
plastidios, mitocondrias y cromosomas hace a la microinyeccion una 
tecnica valiosa y versatil para la transformacion de plantas.




La microinyeccion utiliza dispositivos microcapilares y sistemas de 
microscopia para depositar DNA en el interior de celulas definidas, de 
modo que la celula inyectada pueda sobrevivir y proliferar. Como en el 
caso de la biolistica, la microinyeccion realmente descarga el DNA en la 
celula. En comparacion con la primera, la microinyeccion presenta 
algunas desventajas: solamente una celula recibe el DNA por cada 
inyeccion, y el manejo de la tecnica requiere mas pericia y mayor 
instrumentacion. Tambien tiene ventajas:  (i) puede optimizarse la 
cantidad de DNA descargado;  (ii) el experimentador puede decidir en que 
celula introduce el DNA;  (iii) la descarga es precisa y predecible, 
incluso en el nucleo de la celula, y esta bajo control visual;  (iv) 
pequen~as estructuras (p. ej. microesporas y pro-embriones de pocas 
celulas), que no estan disponibles en las grandes cantidades que 
necesita un experimento de bombardeo, pueden ser alcanzadas por esta 
tecnica; (v) unidades definidas micro-inyectadas pueden ser cultivadas 
en micro-cultivo; y (vi) en el caso de que puedan regenerarse pro-
embriones cigoticos, la  microinyeccion ofrece un modo de transformacion 
abierto a cualquier especie y variedad con reproduccion sexual. Una 
mayor sofisticacion del metodo consiste en la microinyeccion de 
liposomas, en los que se ha depositado el DNA. La microinyeccion en 
celulas diferenciadas puede facilmente descargar el DNA en la vacuola, 
donde es degradado. Por el contrario, la microinyeccion de liposomas en 
la vacuola conduce a su fusion con el tonoplasto, liberandose el 
contenido del liposoma en el citoplasma.






Macroinyeccion.


El uso de agujas  de inyeccion con un diametro mayor que el diametro 
celular conduce a la destruccion de aquellas celulas  en las que el DNA 
ha sido depositado. La integracion del DNA requiere que este se desplace 
desde celulas adyacentes heridas, con los problemas que esto conlleva 
relativos al paso a traves de las paredes celulares por la macromolecula 
del DNA. Tras el primer experimento de inyeccion de un gen testigo en el 
tallo del meristemo floral de centeno, con claras evidencias de haber 
ocurrido la  transmision sexual del caracter a la descendencia, no ha 
sido posible reproducir el experimento a gran escala. Es dificil 
comprender como el DNA pudo alcanzar las celulas esporogenicas en el 
experimento mencionado, teniendo no solo que transmitirse a las celulas 
vecinas, sino viajar a traves de muchas capas de celulas.






Fibras de carburo de silicona.


Recientemente se ha descrito un metodo de descarga de DNA mediante 
fibras de carburo de silicona que actuan como microagujas. Mediante una 
fuerte agitacion de un cultivo celular en suspension, en presencia de un 
medio liquido, DNA plasmidico codificando un gen testigo, y fibras de 
carburo de silicona, se obtiene la expresion transitoria del gen en 
celulas de maiz y tabaco.  Es necesario elucidar los mecanismos 
moleculares que actuan en estas transformaciones, asi como ensayar 
nuevos materiales fibrosos que mejoren los resultados obtenidos.








Incubacion de DNA en tejidos o celulas.


Ha habido muchos intentos de poner en contacto  directo  plantulas, 
organos,  tejidos, celulas o cultivos celulares de  numerosas especies  
vegetales con DNA exogeno y marcadores geneticos definidos. Los 
tratamientos incluyen disen~os experimentales encaminados a abrir los 
plasmodesmos y provocar la perdida de estructuras de pared celular. 
Algunos tratamientos intentan asegurar una cantidad suficiente de 
celulas competentes. No se ha descrito ningun caso de transformacion  
integrativa, aunque si de tipo transitorio. Las tecnicas como esta, que 
tratan de pasar genes funcionales a traves de la pared celular parecen 
tener pocas  probabilidades de exito, ya que esta es una barrera 
perfecta para las grandes moleculas de DNA, ademas de una trampa eficaz. 
Se ha logrado la trasferencia de DNA exogeno al trigo, aunque en 
frecuencias muy bajas,  via A. tumefaciens,  en cultivos de embriones 
sometidos a digestiones enzimaticas parciales previas a la incubacion 
con la bacteria. No esta claro que el proceso sea el normal mediado por 
los genes vir   del pTi y las secuencias de los bordes del DNA-T. Se 
hace necesaria una mayor evidencia experimental sobre este metodo.






Incubacion de DNA en semillas y embriones desecados.


La estrategia de este metodo se basa en dos fenomenos que aparecen en el 
tejido seco. El primero es el enorme gradiente de potencial hidrico que 
se forma entre la celula y la solucion acuosa. El segundo es la 
desorganizacion de las membranas celulares en bajas condiciones de agua, 
lo que les hace muy permeables. Utilizando embriones somaticos se 
facilita mucho la desecacion, al carecer estos de la cubierta y el 
endospermo presentes en las verdaderas semillas.   En condiciones de 
rapida entrada de agua y de alternaciones en las membranas es posible 
conducir DNA plasmidico al interior de la celula desecada, atravesando 
la pared celular que bajo estas condiciones es relativamente porosa para 
el DNA. Por medio de esta tecnica se han obtenido transformantes en 
varias especies (alfalfa, arroz), pero falta por comprobar si se produce 
la integracion real del DNA en el genoma de la planta, y si esta es 
estable en terminos geneticos.






Transformacion del polen.


Esta perspectiva se remonta a primeros de los setenta y se basa en la 
posibilidad de que el DNA pueda ser recogido dentro del polen en 
germinacion e integrarse en el nucleo espermatico o alcanzar el cigoto 
con el tubo polinico. Realmente, de funcionar, seria el metodo ideal 
para la transferencia de genes en plantas: el supervector. La 
polinizacion con polen germinado en presencia de DNA en ocasiones ha 
producido resultados sorprendentes que podrian interpretarse como 
evidencias de transferencia genica. Sin embargo, nunca se ha demostrado 
la correspondencia entre un fenotipo observado y su correspondiente gen 
causal, incluso en experimentos a gran escala realizados por 
laboratorios experimentados. Una vez mas aparece el problema de la pared 
celular y de las nucleasas externas e internas, por lo que la tecnica no 
parece ser muy prometedora. Se ha descrito la transferencia de genes 
bacterianos en el trigo mediante pipeteo de las espiguillas con 
suspensiones de Agrobacterium  como vector. Esto es factible debido que 
el polen de trigo, al igual que el de petunia, contiene factores 
difundibles (identificados como flavonol-glicosidos) que inducen la 
region vir  del pTi. La tecnica requiere mas confirmaciones.






La ruta del tubo polinico.


Esta tecnica permitio obtener plantas transgenicas de arroz hace unos 
an~os. Colocando una gota de una solucion de  DNA exogeno en los 
estigmas cortados de las flores, la solucion del DNA fluye hacia abajo a 
traves de la ruta del tubo polinico y entra en la celula en el saco 
embrionario. Se obtuvieron semillas maduras y se germinaron las plantas 
transgenicas. Sin embargo, no se demostro que el gen exogeno se 
transmitiera a la siguiente generacion. Resulta atractiva la posibilidad 
de descargar DNA en el cigoto, por la via del tubo polinico, en el 
transcurso de la fertilizacion normal.  Sin embargo, es dificil de 
interpretar como puede funcionar el sistema, ya que el DNA se veria 
atrapado por la pared celular, probablemente existan nucleasas en el 
tubo polinico, y no se conocen sistemas de transporte.  Son necesarios 
mas experimentos para confirmar las posibilidades de esta tecnica.








Microlaser.


Un chorro de microlaser enfocado en el sistema de iluminacion de un 
microscopio puede usarse pare abrir agujeros en la pared celular y en la 
membrana plasmatica. Se esperaba que la incubacion de celulas perforadas 
con volumenes de DNA podria servir de base a un metodo de transformacion 
sin vectores. No hay datos concluyentes acerca de la eficacia de este 
metodo, que tendria como competidores a los ya eficaces bombardeo de 
particulas y microinyeccion.






Electroforesis en tejidos.


Se intenta transmitir DNA mediante electroforesis, a traves de 
meristemos de semillas de cebada en germinacion.  Existen datos 
esperanzadores, pero sin certezas sobre los mismos.








Sonicacion.


La sonicacion es un metodo nuevo de transferencia de genes en 
protoplastos y celulas intactas. El mayor efecto de la sonicacion se 
cree que sea debido a la cavitacion acustica, particularmente a bajas 
energias acusticas. Debido a este fenomeno se producen burbujas que 
crecen hasta que implotan, y con rapidas oscilaciones en el taman~o de 
las burbujas. Los efectos quimicos de este proceso pasan por la 
formacion de radicales libres, dan~os en la pared celular, alteraciones  
en la permeabilidad de la membrana, aberraciones cromosomicas menores, y 
cambios de tipo fisiologico. Mediante sonicacion se ha introducido  de 
manera eficiente DNA plasmidico en protoplastos de remolacha y tabaco, 
lograndose expresion transitoria de un gen testigo. Aunque no se conoce 
el mecanismo de permeabilizacion acustica, el hecho de que pueda ser 
utilizada en protoplastos, celulas en suspension y fragmentos de tejido, 
junto a la sencillez del equipo necesario, hacen que esta tecnica pueda 
tener potencial en el futuro. 












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Cuadro 1. Especies en las que se han obtenido plantas transgenicas.




Tomate Algodon Fresa Frambuesas Patata Apio Crisantemo Pepino Clavel 
Colza Can~a de azucar Lechuga Guisante Rabano Batata Lino Zanahoria 
Ipomoea Alfalfa Loto Coliflor Melon Soja Remolacha Tabaco Rosa Manzano 
Maiz Papaya Arandano Vid Centeno Kiwi Petunia Alamo Esparrago Regaliz 
Arabidopsis Nogal Repollo Dedalera Berenjena Picea blanca Achicoria 
Canola Peral Arroz Brocoli Cafeto Mostaza Girasol Trigo comun Avena 
Kalanchve Petunia Mijo Pasto elefante Raygrass Sorgo T. monococcum 
Triticale Tritordeo Cebada




















Cuadro 2.  Biotecnologia de valor comercial en agricultura y alimentos.




Producto,Alimento / Beneficio / Tecnologia / Participantes




COLZA, MAIZ, SORGO / Produccion de hibridos sin contaminacion por 
autofecundacion y sin castracion masculina, incluso en plantas con 
androceo y gineceo proximos / Expresion de un gen que destruye las 
celulas  productoras de polen; un segundo gen se utiliza para restaurar 
la fertilidad / Plant Genetic System N.V. y  Universidad de California 
(en Los Angeles)


COLZA (aceite) / Composicion de laurato y esterato mas elevada 
/Manipulado geneticamente con proteina transportadora 12:0-acil 
thioesterasa a partir de formas silvestres / Calgene


COLZA (aceite) / Alto contenido en aceite hidrogenado para margarina / 
Ingenieria Genetica. / Calgene


COLZA / Resistencia al herbicida Sencor / Fusion celular / Institute for 
Biotechnology, Bayer


COLZA (aceite) / Aceite de freir a alta temperatura, bajo en grasa 
saturada (oleico alto, palmitico bajo) / Mejora clasica, cultivo de 
anteras, y muestreo por RFLP / DNA Plant Technol. DuPont, Agrigenetics-
Mycogen.


CUCURBITACEAS / Resistencia a virus, hongos y bacterias / Resistencia 
genetica / Asgrow Seed Co. 


ESPARRAGOS / Semillas de esparrago que no requieren escardado. / Cultivo 
de tejidos de la parte masculina / Washington State University, otros 


FRAMBUESAS / Incrementar el tiempo posible de transporte / Control del 
etileno por ingenieria genetica / Agritope


FRESAS / Resistencia a la congelacion; permite la produccion temprana / 
La deleccion de un gen de Pseudomonas syringae  reduce la formacion de 
cristales en plantas rociadas con la bacteria / DNA Plant Technology, 
AGS, UC Berkeley


FRESAS / Incremento en los niveles de acido elagico, un agente anti-
cancer que inhibe carbohidratos aromaticos policiclicos, nitrosaminas, 
aflatoxina y aminas aromaticas / Se prepara la insercion del gen clonado 
del acido elagico / USDA-ARS


GIRASOL, COLZA / Alteracion en la composicion de acidos grasos y aceite 
mas nutritivo con menor contenido en grasa saturada / Por aplicacion de 
tecnologia Allelix  recientemente adquirida / Pioneer HiBred


GIRASOL (aceite) / Aceite con alto grado de mono-insaturaciones / Mejora 
clasica, Investigacion en prog. transferencia genetica. / SVO 
(Lubrizol), Mycogen, Calgene 


LECHUGA (Iceberg enana) / Cogollos  de lechuga de taman~o racion / 
Mutagenesis con EtilMetano-Sulfonato en variedades de floracion temprana 
seguido de retrocruzamiento con Iceberg / USDA-Salinas, CA 
(desarrollador), Salina Food & Safeway Store (tests), Empresas de 
semillas implicadas


LECHUGA, TOMATE (posteriormente MAIZ, ARROZ, TRIGO) / Los Lepidopteros 
son infectados y muertos selectivamente, previniendo dan~os en los 
cultivos. / Pulverizacion de productos insecticidas de origen viral / 
Crop Genetics para la produccion; DuPont para la distribucion y  
comercializacion


MAIZ / Resistencia a insectos (Coleopteros y  Lepidopteros) / Insertar 
genes de Bacillus thuringensis  en el maiz / Biotechnica Int.,DeKalb 
Genetics  Corp., Monsanto Co. USDA, y Pioneer  HiBred


MAIZ / Reducir el dan~o producido por el taladro del maiz / Incide, un 
bioinsecticida disen~ado geneticamente, usado para tratar las semillas 
antes de la siembra / Crop Genetics


MANZANAS (Golden Delicious, Greensleeves) / Resistencia a insectos / 
Insercion de un gen de resistencia a insectos de origen bacteriano / 
U.C. Davis & Plant Research Laboratory


MELON (Euromelon) / Tiempo de venta mas largo. Fruto de alta calidad, 
maduracion segun demanda / Insercion de un gen antisense para (pMEL1) 
que codifica el enzima ultimo de la sintesis del etileno / Francia, 
Reino Unido, Espan~a, Grecia; proyecto conjunto


PALMA (datil, aceite, palmito) / Cultivos mas facil de establecer y mas 
sanos. / Micropropagacion / ESCAgenetics (mitad de los 80)


PATATA / Verdaderas semillas de patata / Tecnologia para producir 
semillas a partir de la flor de la patata / Potato Center, Lima, Peru, 
Escagenetics Corp.


PATATA (mejicana) / Resistencia a virus. / Genes de la capsida 
introducidos en la patata / Monsanto, ISAAA & CINVESTAV


PATATA / Plantas libres de virus con un incremento notable de la 
produccion / Cultivo de tejidos. / NPI y Plant Genetics durante los 80; 
otros en la actualidad


PATATA / Patatas fritas con menos grasa / Introduccion de un gen de 
produccion de almidon proveniente de E. coli;  las patatas geneticamente 
alteradas tienen del 30-60% mas almidon y menos humedad; absorben menos 
aceite al freirse / Monsanto, Michigan State U. University of Idaho


PATATA / Resistencia a nematodos parasitos Resistencia a enfermedades./ 
No descrito. Fusion de protoplastos de patata cultivada y tomate 
silvestre / Mycogen, Monsanto Kirin Brewery Co. Ltd.


PATATA / Resistencia de las semillas a los virus X e Y de la patata / 
Microtuberculos a partir de biorreactores / Calgene, Inc.; Kirin  
Brewery Co. Ltd., MOGEN


PATATA, TOMATE (y ALGODON) / Resistencia a plagas de Coleopteros y 
Lepidopteros;  reduccion de tratamientos quimicos. / Expresion de genes 
derivados de B. t. para una endotoxina que interrumpe el transporte 
ionico de membrana en el digestivo del insecto / Monsanto, Ciba-Geigy  
Plant Genetic Systems, N.V. Mas de 18 empresas  trabajan con genes  B.t.


PATATA /Sabor mas dulce. / nsercion de un gen antisense que bloquea la 
ADP-glucosa pirofosforilasa por lo que la sacarosa no se convierte en 
almidon. / Institute of Genetics (Berlin)


PLATANOS / Plantas provenientes de cultivos de tejidos libres de virus y 
nematodos / Cultivo de tejidos / Oglesby Plant  Laboratories, Oscar 
Arias Labs


PLATANOS / Deteccion temprana del hongo Singatoka (rayado negro) como 
parte de un control integrado de plagas / Tecnologia disponible para los 
kits de deteccion / No descrito


SOJA / Bajo contenido en acido palmitico (3,5% contra el 10% normal) / 
Fueron cruzadas dos lineas de soja con genes distintivos / Iowa State 
Univ. Purdue Univ. USDA-ARS


SOJA/LEGUMBRES / Incrementar la productividad con una aplicacion 
limitada de fertilizantes / El uso de lineas mejoradas de Rhizobium  en 
el suelo para incrementar la fijacion del nitrogeno. / Biotechnica Int. 
(hasta principios de los 90) 


SOJA / Resistencia a Glifosato / Insercion del gen de la 5U-
enolpiruvilsikimato-3U-fosfato sintetasa / Calgene, Monsanto, Agricetus


SOJA / Mayor contenido en metionina, la proteina es completa para la 
alimentacion avicola y en el Tercer Mundo / Insercion de un gen que 
enriquece en Met. de la nuez del Brasil / Plant Cell Research (Ferruzzi 
& Univ. of Hawai);Pioneer HiBred


TOMATES, PATATAS, PEPINOS, MELONES, etc. / Resistencia a enfermedades 
virales; incremento de rendimientos con menos tratamientos quimicos / 
Expresion de genes que producen proteinas de cubierta  viral / Monsanto, 
Washington Univ., Asgrow Seed Co., y otras empresas


TOMATES / Maduracion lenta de tomates que se mantienen verdes, firmes y 
sin sabor hasta que se les expone a etileno exogeno / Expresion del ARN 
antisense para la ACC sintetasa que bloquea la produccion de etileno / 
Plant Gene Expression Center, U.S.D.A.; muchas empresas implicadas


TOMATES / Alto contenido en solidos y alta viscosidad (pectina); menor 
tiempo de coccion para productos enlatados (pasta, salsa de tomate, 
etc.) / Expresion de nuevos genes, mejora tradicional, variacion 
somaclonal, y analisis por RFLP / DNA Plant Technology, Calgene, 
Campbell Soup, Monsanto, ESCAgenetics


TOMATES / Ablandamiento lento de los tomates los cuales pueden 
permanecer firmes mas tiempo durante el transporte o el almacenamiento / 
Expresion de ARN antisense para la poligalacturonasa que de otro modo 
podria degradar la pectina / Calgene, para poner en el mercado en 1993 
bajo el nombre TFlavr-Savr


TOMATE / Resistencia a la putrefaccion tras almacenamiento. Periodo de 
maduracion mas largo Resistencia a las heladas. / Los tomates producen 
el enzima quitinasa que los protege contra los hongos. Un enzima, no 
descrito Insercion de genes de bacterias del suelo Insercion del gen de 
un pez / DNA Plant Technologies, DNA Plant Tech., Monsanto, DNA Plant 
Tech.


TOMATE / Maduracion de los tomates Rcon interruptorS continua tras el 
almacenamiento sin etileno / Variacion somaclonal / DNA Plant Tech.


TOMATE / Control del grado de ablandamiento, color y sabor. / 
Reordenacion o duplicacion de los genes existentes / ICI (Hunt-Wesson)


TOMATE, LECHUGA / Sabor mas dulce. / Transferencia de un gen de 
monellina / UC, Berkeley


TRIGO / Alto contenido en amilopectina / Trabajando en la insercion de 
antisense / Ciba-Geigy via Sogetal


TRIGO / Resistencia al herbicida glutofinato / Insercion del gen de la 
fosfinotricin acetiltransferasa / U. Florida, Monsanto